藥明康德內容團隊推出細胞和基因療法系列科學講座，邀請細胞和基因療法領域具有影響力的學者，通過視頻講座從各自角度深度解讀前沿科學進展、呈現對領域發展的深刻洞見，共同推動創新療法的研究進展、加速為全球患者帶來突破。
在本期視頻講座中，我們邀請到上海科技大學生命科學與技術學院教授、基因編輯中心主任陳佳教授，為我們分享“新型堿基編輯技術的開發與應用”。
2014年，結束了在美國國立衛生研究院（NIH）的5年博士后研究后，陳佳教授在上海科技大學組建了自己的實驗室，從事DNA損傷修復機制的基礎研究。此時，生命科學領域一場方興未艾的技術革命吸引了陳佳教授的關注。
2012年，Emmanuelle Charpentier教授和Jennifer Doudna教授發表了CRISPR/Cas9基因編輯系統，利用Cas9核酸內切酶實現了特定位點對DNA的精準切割；不到一年后，張鋒教授團隊首次將CRISPR-Cas9基因編輯系統改進并應用于哺乳動物和人類細胞。自此，人們擁有了能高效改寫DNA的“基因魔剪”。
盡管DNA損傷修復的基礎研究與基因編輯技術看似相距甚遠，但在陳佳教授看來，兩者其實暗藏著密切的聯系：“DNA的損傷修復不受我們控制，產生隨機的修復產物；相反如果我們能控制DNA損傷修復的過程，這個可控的改變就是基因編輯。”
因此，長期從事基礎研究的陳佳教授依舊對勢頭火熱的基因編輯技術保持了開放的心態。而最終促使陳佳教授轉變研究方向的，是堿基編輯技術的出現。
從基礎到技術：打造改寫堿基的“筆”
毫無疑問，CRISPR/Cas9基因編輯具有跨時代的意義，但這項技術在臨床治療中也存在著難以克服的安全隱患。由于核酸酶在編輯時需要首先切斷DNA雙鏈，這個過程中的任何錯誤——無論是染色體的缺失、易位，還是識別錯堿基序列導致的脫靶效應——以及DNA雙鏈斷裂本身導致的細胞凋亡或癌變，都可能讓基因編輯成為孕育著危險的溫床。
2016年，哈佛大學劉如謙（David Liu）教授提出了全新的堿基編輯理念（Komor et al.，Nature，2016）。對于CRISPR/Cas9與堿基編輯的對比，陳佳教授用了這樣的比喻：CRISPR/Cas9需要在基因組中產生大片段的創傷再予以修復，如同是一場傷筋動骨的手術；而堿基編輯則是“化刀為筆”，不再用“手術刀”來剪切DNA，而是直接用“筆”改寫錯誤的字母，也就是堿基。因此，堿基編輯有機會從根本上避免DNA雙鏈斷裂帶來的風險，對基因突變進行更為精準的定點校正。
根據改寫的堿基不同，堿基編輯器包含胞嘧啶堿基編輯器（CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（ABE）兩類。其中，胞嘧啶堿基編輯使用的“筆”是胞嘧啶脫氨酶，這種酶能夠將靶點處的胞嘧啶轉變為尿嘧啶。而陳佳教授研究的，恰好是這支“筆”的工作機制。
▲胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器的工作原理
（圖片來源：Wang et al.，Molecular Cancer，2022）
“由于堿基編輯與我之前做的胞嘧啶脫氨酶損傷修復機制關聯性非常強，當時我想可以嘗試進行工具的研發。嘗試之后我發現生物技術方向相當適合，于是我就逐漸地將實驗室的重心從純基礎研究轉變成基于機制研究的生物技術研發。”在陳佳教授看來，內心的喜好加上合適的時機，最終決定了自己的科研方向。
攻克脫靶效應：源自意外的發現
在此后數年間，陳佳教授團隊與合作者先后開發出了具有高編輯效率與高產物純度的增強型堿基編輯器（enhanced Base Editor，eBE）、能在基因組A/T富集區域內精準編輯的Cpf1（一種與Cas9互補的新型蛋白）的堿基編輯器、在G/C富集區域和高甲基化DNA區域內實現高效編輯的hA3A堿基編輯器，以及將Cpf1與hA3A結合，能避免激活細胞DNA損傷響應通路，從而避免細胞凋亡的堿基編輯系統BEACON。
這些全新的突破提升了堿基編輯的準確性、效率與安全性，拓展了堿基編輯工具的應用范圍。但此時的堿基編輯技術還面臨著一項全球科學家尚未攻克的重大障礙，那就是大規模的脫靶效應。
胞嘧啶堿基編輯器包括兩個核心元件：識別目標位點的定位器（locator）——向導RNA（guide RNA），以及執行堿基替換的效應器（effector）——胞嘧啶脫氨酶。理想情況下，胞嘧啶脫氨酶應該僅在目標位點發揮作用，但由于其高結合活性，這種裸露在外的酶既能在guide RNA的介導下在脫靶位點產生脫氨反應（稱作guide RNA依賴性突變），也可以在不依賴于guide RNA的情況下，在基因組DNA隨機產生的單鏈區域進行脫氨反應（即guide RNA非依賴性突變）。這兩種脫靶突變，尤其是后者很難被檢測到，可能帶來嚴重的后果。
為了解決脫靶的難題，陳佳教授團隊最初的設計思路是將胞嘧啶脫氨酶拆成兩部分，它們單獨存在時不具備活性，只有兩者結合才能進行脫氨反應，從而實現靶向編輯的目標。
但實際的實驗結果卻向研究團隊潑了一盆冷水。他們將胞嘧啶脫氨酶拆開后，發現胞嘧啶脫氨酶的調節結構域成為了另一部分的抑制劑。回憶這段實驗歷程時，陳佳教授告訴我們，看到結果嚴重偏離預期，他當時也感到很難過。但他們很快意識到，這個意外出現的抑制劑，恰好可以用作胞嘧啶脫氨酶的“鎖”，限制其在靶向位點以外的活性。
tBE的誕生：實現“零脫靶”
基于這一思路，陳佳教授團隊與合作者開發出了名為變形式堿基編輯器（transformer Base Editor，tBE）的新型堿基編輯工具，并在2021年通過Nature Cell Biology期刊發表了這項突破性進展。
陳佳團隊發現，自然界天然存在胞嘧啶脫氨酶的抑制劑，相當于給胞嘧啶脫氨酶上鎖，同時避免了上述兩類脫靶突變。當然，只有鎖還不夠。到達目標位點后，還需要解開這把鎖，從而恢復脫氨酶的活性。為此，研究團隊的策略是直接將鎖切斷。他們在抑制劑和胞嘧啶脫氨酶之間添加了一個蛋白酶的酶切位點，它可以在靶向位點處將鎖切掉，達到了“解鎖”的目的。
基于這一系列的設計，胞嘧啶脫氨酶僅在靶向位點處進行非常高效、精準的編輯，避免在脫靶位點處產生任何突變。
“一些特別關鍵的技術往往不是我們計劃好的，而是偶然發現的。”對于這項最初源于意外的突破，陳佳教授談到。
后續實驗證實，對于guide RNA依賴性與非依賴性脫靶突變，tBE都完全實現了零脫靶。“我們的tBE消除了所有的脫靶，同時還能保證它非常高效的靶向編輯，這是一項非常不容易的成果。”
tBE的下一步
陳佳教授實驗室的一系列堿基編輯工具已經申請、獲得了多項國際與中國的專利授權。其中，tBE已經獲得了美國、中國、澳大利亞等多個國家和地區的專利授權。據陳佳教授介紹，相對于現有的堿基編輯系統，tBE在臨床治療的應用范圍得到極大的擴展。tBE既能搭配腺相關病毒（AAV）、脂質納米顆粒（LNP）等多種體內遞送方式，大幅提升體內的編輯效率；也能通過電轉等方式在體外抽提的造血干細胞中進行高效的編輯。此外，tBE還可以結合CAR-T細胞療法，在T細胞里進行雙靶點甚至多靶點的高效編輯。
目前，tBE已經在臨床應用中體現功效。例如，tBE對β-地中海貧血等罕見病已經展現出超過80%的高編輯效率，其中治療β-地中海貧血的管線正在系統進展，相比于傳統Cas9核酸酶基因編輯技術展現出更為優異的療效和安全性。此外，利用tBE協助腫瘤免疫治療、增強CAR-T療效、治療傳染性疾病等管線的開發均在進行中，體現出靶向編輯效率高且無脫靶現象的優勢。
“接下來，我們希望將tBE的理念應用到更多編輯工具中，在tBE之外開發出其他高精度的新型編輯器；另一方面，我們希望在遞送方面實現突破，例如實現體內的組織器官特異性遞送。”除了上述短期內希望看到的突破，陳佳教授還展望了更長遠的未來：如果能實現長片段的定點插入、在指定器官內進行體內基因編輯，未來的基因療法將迎來顛覆性的變化。
過去十年，基因編輯技術的發展改變了陳佳教授的研究方向，而他開發的工具正在進一步推動基因編輯的應用，為基因編輯的前景開辟出更多可能性。在陳佳教授看來，研究方向的變化改變了他的思維方式，使得他在好奇心驅動之余也會從疾病與臨床需求的角度思考，尋找具有轉化潛力的課題。而對于面臨方向選擇的年輕學生，陳佳教授也給出了自己的建議：關注自己的內心喜歡什么、保持open mind，為自己的科研生涯預留多幾個選項。
參考資料：[1] Wang, L., Xue, W., Zhang, H. et al. Eliminating base-editor-induced genome-wide and transcriptome-wide off-target mutations. Nat Cell Biol 23, 552–563 (2021).
https://doi.org/10.1038/s41556-021-00671-4[2] Komor, A., Kim, Y., Packer, M. et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016).
https://doi.org/10.1038/nature17946[3] Wang, SW., Gao, C., Zheng, YM. et al. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer 21, 57 (2022).
https://doi.org/10.1186/s12943-022-01518-8
